外周血單個核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），是指外周血中具有單個核的細胞，包括淋巴細胞（Lymphocyte）、單核細胞（Monocyte）、樹突狀細胞（DC）和其他少量細胞。

1     原理

單個核細胞的體積、形態(tài)和比重與外周血其它細胞不同，紅細胞和多核白細胞的比重超過1.080，單個核細胞的比重為1.070左右，血小板為1.030左右。因此，可利用各種血細胞和單個核細胞比重之間的差異將各種血細胞與單個核細胞分離開來。

Ficoll密度梯度離心法是分離、純化PBMC的方法。Ficoll是蔗糖的多聚體，中性，平均分子量400000，當密度為1.2g/mL，未超出正常生理性滲透壓，也不穿過生物膜，故常用作PBMC分離的分離液。紅細胞、粒細胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細胞和單核細胞的比重小于或等于分離液比重，離心后漂浮于分離液的液面上，也可有少部分細胞懸浮在分離液中。吸取分層液液面上的白膜層細胞，并進行適當?shù)那逑?，就可從外周血中分離到較高純度的單個核細胞，即PBMC。

2     方法

1） 取新鮮抗凝全血，按照1：1比例加入1×稀釋洗滌液，將血液進行稀釋（以降低血液粘稠度），輕柔混勻，備用。

2） 向無菌離心管內(nèi)加入適量的單個核細胞分離液，將稀釋后的血樣平鋪到分離液液面上方（分離液：稀釋全血=1：2），保持兩液面界面清晰。 

3） 800g，室溫，離心 20min-30min（注：設(shè)置較慢的加速度和減速度，如果有十檔，設(shè)為第三檔）。 

4） 離心結(jié)束后，吸棄血漿層，小心吸取PBMC層（即白膜層）并轉(zhuǎn)移至15mL離心管中。離心結(jié)束后，管內(nèi)液面從上至下依次為稀釋血漿層、PBMC層、分離液層和紅細胞層（見圖1）。 

圖1 稀釋外周血離心前后的分層狀態(tài)圖

5） 向離心管中加入10mL 的1×稀釋洗滌液重懸細胞，250g，室溫離心 10min ，棄上清。重復該步驟 1~2 次，即可用于后續(xù)試驗。

3     注意事項

1） 不同種屬動物單個核細胞的比重有一定差異，請選擇合適的分離液進行PBMC的分離。

2） 血液新鮮程度是影響分離效果的關(guān)鍵因素，請盡量使用采集后24h內(nèi)的血液進行PBMC分離。

3） 為保證細胞的活力，整個操作過程請輕柔，避免對細胞造成機械性的損傷。

4） 為保持細胞狀態(tài)良好，請盡量縮短整個試驗的周期。

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